领跑液体活检的三驾马车：CTCs、ctDNA、外泌体
| 上篇说到液体活检是以衍生于肿瘤部位的CTCs、循环游离DNA或RNA、外泌体等为标志物，从患者体液中提取、分析并发挥作用于肿瘤诊断的早期应用。组织活检是应诊断与治疗需要产生的一种从患者体内切取、钳取或穿刺等取出病变组织进行病理学检查的技术。 |
由于肿瘤的异质性较强，不同个体的肿瘤、同一个体不同部位的肿瘤，同一部位的不同亚克隆组织，同一亚克隆的不同细胞，其中的遗传信息都可以是不尽相同的。传统的组织活检存在有局限性；而液体活检取自全性循环DNA分子，更全面且异质性偏差低，不同靶标类型也具有不同的检测特点。目前，领跑肿瘤液体活检技术的三驾马车分别是 CTCs、ctDNA、外泌体[1]，小编将在本篇中为大家详细介绍。
循环肿瘤细胞(CTCs)
循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs），是从原发部位分离，进入血液循环，通过血液循环播散并进行远处转的肿瘤细胞[2]。1993年，德国汉堡大学的Klaus Pantel教授提出了原型的新概念，相当于目前对“肿瘤液体活检”的定义[3]。这个概念是用一个工具箱来证明的，该工具箱重新装满了患者血液中的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体和其他标记物，根据这些标记物将癌症患者与健康个体区分开来，并将其分类为不同的疾病阶段[4]。
图1 循环肿瘤细胞（CTCs）
（来源：Bourré ,et all, Crown Bioscience,2020）
研究表明，CTCs在肿瘤直径＜0.1cm时就已表现出异常，在时间上比传统影像学早6~9周[5］。所以，CTCs可作为肿瘤患者独立预后因子、靶向治疗的标志物和靶点，在肿瘤早期诊断也具有重要的临床价值。但由于CTCs在血液中含量极低且半衰期短，导致存在有捕获率低，灵敏度差的情况[6]。
循环肿瘤DNA(ctDNA)
循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）是人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征来自肿瘤基因组的DNA 片段。ctDNA可反映患者体内肿瘤的全景数据，全面反映与肿瘤组织相同的突变基因组信息，包含突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常以及甲基化等相关突变信息。深度测序检测ctDNA显示[7］，在72％的患者中，ctDNA可早于影像学5.2个月检测到肿瘤，并在首次治疗后复发率的准确度达到94％。
图2 循环肿瘤DNA（来源：阳光肺科）
通过检测ctDNA，可获得肿瘤的相关踪迹信息，ctDNA在肿瘤筛查、早诊诊断、微小残留病灶和复发监测、疗效评价、指导靶向药物使用及生存评估等各方面均具有一定的临床应用前景。The New England Journal of Medicine研究结果发现：ctDNA检测作为一种无创的检测方法，能够真实的反映实体瘤组织中的基因突变图谱与频率，是作为治疗效果的评估及治疗后临床随访的一项重要监测指标。但在早期无症状个体中，ctDNA含量较低，特定突变更加微乎其微，在肿瘤筛检中存在一定限制[8]。
外泌体（Exosome）
外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径约为40-100 nm。外泌体作为细胞分泌囊泡的一种亚型，存在于生物体液中，并参与多种生理和病理过程。在肿瘤微环境中，外泌体参与了诱导血管生成、细胞迁移和增殖、炎症反应、免疫抑制、逃避免疫监视和转移等过程。通过将多种类型的“货物”，如蛋白质、脂质、酶、转录因子、DNA、mRNAs、miRNAs和lncRNAs运送到基质细胞，外泌体保障了微环境中的细胞通讯，使得受体细胞向癌细胞转变，并促进了原发性肿瘤的生长。因此，通过检测其中相关蛋白和mi RNA等标志物可以分析肿瘤相关的信息。
图3 外泌体结构（来源：Int. J，et all，Mol. Sci. 2020）
患者体液中的外泌体水平也可用于肿瘤的早期诊断，外泌体其内容物的表达水平可以反应病情的变化，作为疗效监测和预后判断的指标[9]。且外泌体具有分布广泛、来源于活细胞、分离鉴定相对简单等优点，引起业内学者深入研究，外泌体定将会成为癌症诊断与治疗中的新希望
CTCs、ctDNA与外泌体的比较
CTCs，ctDNA 和外泌体虽然都是液态活检的检测对象，但各有特色。从本质上来说，CTCs，ctDNA 和外泌体，这三者的特征和用途有较明显差异，可以相互补充。下面是三种方法优劣势及应用的比较：
CTC、ctDNA与外泌体的比较 | |||
标志物 | 优势 | 劣势 | 应用 |
CTCs | 1.具有肿瘤来源特异性 2.DNA、RNA及蛋白质均可获得 3. 能够进行体外试验 | 1.CTC识别的特异性 2.CTC异质性对富集方法的影响 3.CTC对用药指号的意义 | 1.预后分析 2.疗效评估 3.复发监测 |
ctDNA | 1.全面反映肿瘤突变信息 2.肿瘤相关突变特异性高，与靶向药物关系明确 | 1.难以确定组织来源 2.突变频率通常较低，区分肿瘤变异与背景噪音的技术难度较高 | 1.个性化用药指导 2.疗效及耐药监测 3.早期辅助诊断 |
Exosome | 1.非编码RNA、DNA及蛋白质均可获得 2.能够进行体外试验 3.适用性广，作为早期筛查标志物的潜力更大 | 1.目前仍缺乏明确的特异标志物 2.肿瘤外泌体的进一步纯化难度高 | 1.早期筛查 2.转移调控 |
由于肿瘤DNA水平变异研究得最为成熟，而测序技术的发展也为ctDNA检测提供了技术手段。因此，目前ctDNA的应用最为成熟，尤其是在指导用药方面，ctDNA有无可比拟的优势！
美国病理协会指出短期内液体活检更有助于确认临床或放射学上已明显病变患者的恶性肿瘤，是组织活检不可执行情况下的可选方案。基于已获批产品，液体活检大大加速了新药研发的靶点发现、临床试验入组以及伴随诊断的发展，在预后检测、复发评估等方面有着巨大的前景。
总的来说，可多次取材、动态监测肿瘤状态的液体活检，正逐渐成为临床广泛接受的肿瘤检测新技术。但是，目前的检测还存在着一些瓶颈问题，例如不同检测方法与检测对象的结果一致性等，限制了其在肿瘤诊断、监测、预后中的可比性和溯源性。总之，液体活检是一项极具临床应用前景但仍需不断完善的肿瘤检测技术，相信不久的将来，它将为临床肿瘤诊疗提供更精准、更便捷的方法。
参考文献
[1] 王红兵.液体活检在恶性肿瘤中的应用[J].实用医院临床杂志,2022,19(05):198-202.
[2] 夏艳艳,沈瀚,许红攀等.液体活检技术在肿瘤诊断中的最新研究进展[J].现代检验医学杂志,2021,36(03):157-160.
[3] Pantel K, Schlimok G, Braun S, Kutter D, Lindemann F, Schaller G, Funke I, Izbicki JR, Riethmüller G. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 1993 Sep 1;85(17):1419-24. doi: 10.1093/jnci/85.17.1419. PMID: 7688814.
[4] Pantel K, Alix-Panabières C. Real-time liquid biopsy in cancer patients: fact or fiction? Cancer Res. 2013 Nov 1;73(21):6384-8. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-2030. Epub 2013 Oct 21. PMID: 24145355.
[5] TAKAKURA M, MATSUMOTO T, NAKAMURA M,et al.Detection of circulating tumor cells in cervival cancer using aconditionally replicative adenovirus targeting telomerase-positive cells[J].Cancer Science,2018, 109(1):231-240.
[6] ZHANG Xaofen,JU Shaoqing,WANG xudong,et al. Advances in liquid biopsy using circulating tumor cells and circulating cell-free tumor DNA for detection and monitoring of breast cancer[J]. Clinical and Experimental Medicine, 2019，19(3):271-279.
[7] 杨凌舸,罗鹏,陈士奇,王春萌.液体活检技术在肿瘤中的研究与应用进展[J].肿瘤,2018,38(11):1090-1096.
[8] FENIZIAF.Oncogenomics//Circulating Tumor Cells and ctDNA in NSCLC[M].Ytaly Naples:Academic Press,2019:465-475.
[9] GAO Fangyuan, JIAO Fenglong,XIA Chaoshuang, et al. A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2[J].Chemical Science,2019,10(6):1579-1588.
