基于液体活检的体外诊断技术
在前两篇中我们谈到，液体活检的三驾马车是CTC、ctDNA、外泌体，通过其中的生物标志物可以诊断和监测肿瘤等疾病。相较于组织活检，液体活检的优势在于非介入性、可重复获得肿瘤样本，其副作用小、操作简便、成本较低、检测速度快及适应症广，在减小了肿瘤异质性对诊断造成偏差的同时，也能及时地反应肿瘤发展的动态变化。
基于液体活检的体外诊断按照方法学分为生化诊断、免疫诊断、分子诊断三大类，以及从生化、免疫和分子诊断中分化出来的床旁快速诊断POCT。本篇将对以上几种体外诊断技术进行概述
基于液体活检的体外诊断按照方法学分为生化诊断、免疫诊断、分子诊断三大类，以及从生化、免疫和分子诊断中分化出来的床旁快速诊断POCT。本篇将对以上几种体外诊断技术进行概述。
生化诊断
Biochemistry Diagnostic
生化诊断是指有酶反应参与、或者抗原抗体反应参与，主要用于测定酶类、糖类、脂类、蛋白和非蛋白氮类、无机元素类等生物化学指标、机体功能指标或蛋白的诊断方法，是目前最常用的体外诊断方法之一。
生化诊断在我国发展较早，为医院常规诊断检测项目，侧重于已经发生的疾病监测，未来增长速度较慢，试剂国产化率已达到70%以上。大部分仪器也已国产化，目前国产仪器仅在仪器检测速度和一体化上与国外仪器有差距。
免疫诊断
Immunodiagnostics
免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态，可在体内和体外进行。在医学上，是确定疾病的病因和病变部位或确定机体免疫状态是否正常的重要方法；在法医学上，用于血迹鉴定、生物化学的血清成分鉴定和物种进化关系的研究等。例如，ctDNA携带全面的肿瘤细胞基因组变异信息，不仅可以评价单个基因的突变和免疫治疗疗效之间的关系，ctDNA突变总数亦可作为免疫治疗的预测性标志物[1]。除此之外，一些研究报道发现免疫细胞，免疫因子也能预测免疫用药疗效[2-3]。
免疫诊断是我国细分规模最大的体外诊断子行业并仍处于快速发展之中，高端的化学发光已逐步替代酶联免疫成为我国主流的免疫诊断方法，侧重于已经感染的疾病监测，市场规模达到免疫诊断总市场的70%以上。中低端试剂和仪器国产化程度较高，但三级医院等高端市场整体依然被海外巨头垄断，未来高端免疫诊断市场的进口替代是发展方向。
分子诊断
Molecular Diagnostic
分子诊断依靠分子生物学技术，已经成为临床医学的前沿学科，在遗传病，肿瘤等疾病诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。分子诊断主要检测的是核酸，包括DNA和RNA，利用核酸杂交的原理，引物和探针是其常用的工具。目前基于临床检测的技术和方法包括突变/变异检测技术、DNA测序技术、生物芯片技术、PCR技术、荧光原位杂交技术FISH，毛细管电泳和质谱分析技术。分子诊断在全球范围内都处于发展初期，对感染初期和有可能发生的基因性疾病具有独特的检测优势。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是在常规PCR的基础上加入荧光标记探针（如标记荧光素的Taqman探针）或者相应的荧光染料从而达到定量的目的。目前检测实用疾病主要包括遗传病，传染病和肿瘤。ZXF1在肺腺组织中的异常表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移有密切关系，在临床中，其高表达可推测患者预后较差，并推断ZXF1可能通过增强靶蛋白BMP-5和SCFR的表达而影响肺腺癌的进展，临床运用qRT-PCR能够灵敏精确地检测ZXF1 mRNA的表达量[4]。
图1 实时荧光定量PCR技术原理（来源：Soler M,et al,APL Photonics, 2020[5])
核酸杂交技术
核酸杂交技术是遗传学研究和基因诊断的常用方法。主要包括反向斑点杂交和荧光原位杂交。
荧光原位杂交技术FISH是在细胞遗传学水平上检测染色体、基因数目及结构异常的一种分子生物学技术。研究者[6]发现9（p16）号、3号、7号及17号染色体的遗传学改变与膀胱癌的早期发生及发展、复发密切相关。因此使用这种非侵入性且高敏感性、高特异性的FISH技术检测尿液标本中脱落的畸变染色体，用于膀胱癌的早期诊断和术后监测很有意义。
反向斑点杂交具有可以同时检测筛查多个样本，膜条制备时间短，采用非放射性标记引物，避免同位素半衰期带来的稳定性问题等优点。
DNA测序检测
测序技术的不断迭代更新使得测序的结果更加快速准确，Sanger法作为第一代测序技术，也称为双脱氧核糖核酸末端终止法，测序步骤包括模板分离，循环测序，测序产物纯化，毛细管电泳，数据分析等。
图2 Sanger法原理（来源：网络）
Sanger法测序虽准确度高，但是一次测序长度仅为300-1000bp，通量低，速度慢导致第二代测序技术应运而生，采用微循环阵列合成测序法。高通量测序又称下一代测序技术，其能同时对几十万到几百万条的DNA分子并行序列测序。有学者利用NGS检测在宫颈癌细胞系中发现12个基因启动子（ARHGAP6、HAND2、LHX9、HEY2、NKX2-2、PCDH10、PITX2 、PROX1、TBX3、IKBKG、RAB6CHE、DAPK1）存在甲基化，这为宫颈癌的早期检测和临床管理提供了基因特异性甲基化方面的有效标志物[7]。
目前二代测序也是目前应用最广的测序技术，随着技术的不断发展，三代单分子测序，四代纳米孔测序也在逐渐崭露头角。
表1 三种诊断技术的比较
方法 | 代表技术 | 优点 | 缺点 | 应用领域 |
生化诊断 | 胶乳增强免疫比浊技术 | 需求量大、费用低、检测速度快、国内主导品种之一 | 时间长、操作繁琐、有放射污染 | 肝功能、肾功能、糖尿病、血脂、心血管、风湿等 |
酶循环技术 | 检测范围有限 | |||
免疫诊断 | 胶体金 | 快速、简单、准确、无污染 | 检测灵敏度不高、检测范围有限 | 病毒和血源检测、肝炎检测、性病检测、肿瘤检测等 |
酶联免疫 | 成本低、快速 | 检测灵敏度不高、试剂保存时间短、需手工操作 | ||
化学发光 | 线性范围宽、灵敏度高、特异性强、自动化成都高、检测速度快、不受样本数量影响、试剂质量稳定 | 检测通量较小 | ||
分子诊断 | PCR | 特异性强、灵敏度高、简便快捷 | 检测通量较小 | 传染病（流感、肝炎、性病等）、遗传病、肿瘤等 |
原位杂交 | 成本较低 | 精度相对较低、检测通量较小 | ||
基因芯片 | 检测、便捷、准确 | 检测通量较小 | ||
基因测序 | 信息量大、通量高、准确 | 成本高、耗时较长 |
即时检测（POCT）
POCT是指在采样现场进行即时分析，利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到结果的检测方式，其相比其他体外诊断检测来说具有最大的特点就是即时，即地和简便，最快不到一分钟，不受条件限制现场可以由任何人进行操作。
POCT通常通过使用可移动、便携式和手持式仪器（例如，血糖仪、神经传导研究设备）和测试套件（例如，CRP、HBA1C、同型半胱氨酸、HIV 唾液测定等）来完成。当手持设备不可用时，也可以使用小型台式分析仪或固定设备——目的是在患者所在位置或附近收集标本并在很短的时间内获得结果，以便在患者离开前根据需要调整治疗计划[8] 。
图3 即时检测技术（来源：Leila Syedmoradi, et al,Talanta,2021[9])
更便宜、更快和更智能的 POCT 设备增加了 POCT 方法的使用，使它对许多疾病具有成本效益，例如糖尿病、腕管综合症 (CTS) [10] 和急性冠状动脉综合症。此外，在同一样本中同时测量多种分析物，从而实现快速、低成本和可靠的量化成为新的发展趋势[11] 。因此，在过去十年中，多重即时检测 (xPOCT) 对于医学诊断变得越来越重要[12]。
多年来，研究人员已经了解了液体活检的临床潜力。为了推动其广泛应用，现需更多的介入临床试验，以及开发一种算法来结合合适的循环生物标志物。随着检测技术的不断进步，相信液体活检也将成为未来精准医学新趋势。
参考文献
[1] Khagi Y, Goodman A M, Daniels G A, et al. Hypermutated circulating tumor dna:correlation with response to checkpoint inhibitor-based immunotherapy. Clin Cancer Res,2017,23:5729-5736.
[2] Krieg C, Nowicka M, Guglietta S,et al. High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1immunotherapy.Nature Medicine,2018,24 (2) :144-153.
[3] Sanmamed M, Perez-Gracia J,Schalper K, et al. Changes in serum interleukin-8(IL-8) levels reflect and predict response to anti-PD-1 treatment inmelanoma and non-small cell lung cancer patients.Annals of Oncology, 2017,28(8):1988-1995.
[4] Pan GF,Zhou XF,Zhao JP.Correlation between expression of long non-coding RNA ZXF1 and prognosis of lung adenocarcinoma and its potential molecular mechanism[J].Zhonghua ZhongLiu Za Zhi,2017,39(2):102-108.
[5] Soler M, Scholtz A, Zeto R, et al. Engineering photonics solutions for COVID-19. APL Photonics. 2020,5(9).
[6] Phillips JL,Richardson IC.Aneuploidy in bladder cancers:the u-tility of fluorescent in situ hybridization in clinical practice[J].BJU Int,2006,98(1):33-37.
[7] Bhat S, Kabekkodu SP, Varghese VK,et al.Aberrant gene-specific DNA methylation signature analysis in cervical cancer[J].Tumor Biol, 2017,39(3):101042831769457.
[8] College of American Pathologists POCT toolkit". Archived from the original on 2010-12-22.
[9] Leila Syedmoradi, Michael L. Norton, Kobra Omidfar, Point-of-care cancer diagnostic devices: From academic research to clinical translation, Talanta, Volume 225, 2021, 122002.
[10] Tolonen U, Kallio M, Ryhänen J, Raatikainen T, Honkala V, Lesonen V (June 2007). "A handheld nerve conduction measuring device in carpal tunnel syndrome". Acta Neurologica Scandinavica. 115 (6): 390-7.
[11] Spindel S, Sapsford KE (November 2014). "Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use". Sensors. 14 (12): 22313-41.
[12] Dincer C, Bruch R, Kling A, Dittrich PS, Urban GA (August 2017). "Multiplexed Point-of-Care Testing - xPOCT". Trends in Biotechnology. 35 (8): 728-742.
