分子诊断----IVD行业的骄子
在体外诊断众多细分板块中，分子诊断称得上是“明日之星”。分子诊断应用分子生物学方法，通过检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质结构或含量变化而做出诊断的技术。相比于发展成熟的免疫诊断、生化诊断等技术，分子诊断处于快速成长期，是IVD行业中发展最快的细分领域，具有检测时间短、灵敏度更高、特异性更强等优势，被广泛应用于传染性疾病、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。
技术分类
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目前，分子诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片技术、基因测序技术，已广泛应用于临床各科。
基于核酸分子杂交技术的分子诊断技术
核酸分子杂交技术是指不同来源的2条核酸单链，在一定条件下以碱基互补配对的原则特异性形成双链，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)等技术。其中FISH技术是应用有荧光标记的探针与靶片段形成杂交体，通过荧光检测体系获得待测DNA的相关数据，具备特异性强、检测速度快的特点，在产前诊断领域应用广泛[1] 。美国医学遗传学学会于1993年发布了应用FISH进行产前诊断的相关说明[2] ，该技术在产前诊断领域作为核型分析技术的补充已成为专家共识。
图1 核酸分子杂交技术原理（来源：网络）
基于核酸扩增技术的分子诊断技术
20世纪80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)，即体外扩增目的核酸片段的技术。核酸扩增技术目前在临床中应用广泛，至今已经发展出多种PCR技术，包括荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、数字PCR(digital PCR，dPCR)等。qPCR 技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术[3] 。dPCR也称为单分子PCR，其原理是将单个核酸分子放在独立的反应单元中进行PCR扩增后，检测反应室终点荧光并进行分子计数统计实现定量分析。由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，成为研究热点[4] 。
图2 PCR技术原理（来源：Andy Vierstraete,1999）
基于基因芯片技术的分子诊断技术
基因芯片技术是将大量已知序列的核酸探针固定在基片表面，再将其与靶核苷酸杂交，通过对探针的检测获得待测样品的序列信息。依据探针的种类可将基因芯片分成2类，即cDNA微阵列芯片和寡核苷酸微阵列芯片[5]。前者的探针是细胞中特定的mRNA逆转录成的相应的cDNA，而后者的探针为原位合成的寡核苷酸片段。由于基因芯片技术具有自动化程度高、操作简单、通量高等特点，在基因分型、基因表达、单核苷酸多态性检测等方面均有广泛应用。
图3 基因芯片检测原理（来源：网络）
基于基因测序技术的分子诊断技术
基因测序技术始于1977年由Sanger发明的DNA双脱氧链末端终止测序法，由于它的准确率极高，因而被认为是基因测序的“金标准”，但也同时因成本高、通量低限制了其在临床方面的应用。
进入21世纪后，基因测序技术快速发展，第二代及第三代测序技术相继发明。第二代测序技术也称高通量测序(high-throughput sequencing，HTS)技术，相对于一代测序，它可以实现大规模平行测序，基本原理是将基因组分割成短片段，对短片段测序再进行拼接，具备检测用时短、灵敏度高、通量高、经济等诸多优势，极大地推动了分子诊断在临床检测方面的应用，也推进了基因组学的发展。HTS技术是目前临床应用最广的测序技术。第三代测序技术主要是以单分子测序及纳米孔测序为代表，如Oxford Nanopore 公司开发的Min ION纳米孔测序技术，Pac Bio公司开发的SMRT测序技术等[6]。它无须核酸扩增，读长明显优于HTS技术，可在基因组水平辅助个体化医疗，是未来发展的主要技术方向。
图4 使用Illumina平台的DNA测序
（来源：J. M. Churko,et al., 2013[7])
临床应用
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随着分子诊断技术的不断发展，其成为了有效进行疾病诊断的新型临床手段与思路。特别是在感染性疾病、肿瘤和遗传病领域，不仅有效弥补了传统方法的不足，更为疾病预防、诊断、治疗监测和预后评估提供了重要证据。
在肿瘤中的临床应用
肿瘤的发生是基因与环境共同作用的结果，恶性肿瘤的个体化与精准医疗意义重大，分子诊断技术不仅有助于癌症的预防与早期诊断，更在癌症分子分型、预测预后、治疗方案筛选等方面起作用。
FISH技术用于检测染色体数目及结构的改变，而染色体的状态与肿瘤的发展密切相关。应用FISH技术对特定染色体进行检测可以预估癌症的预后，Mian等[8]对81位尿路上皮癌(UC)患者长期随访，使用多色荧光原位杂交技术对患者的9p21(p16)位点及3、7、17号染色体进行检测，筛选膀胱癌复发高风险人群并预估疾病发展。
在核酸扩增技术中荧光定量PCR技术以其独有优势在肿瘤治疗中应用广泛。头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是常见的癌症之一，多项研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是其致病因素之一。Polanska等[9]收集了74例原发性HNSCC组织样本，应用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对15种HNSCC相关分子标志物进行分析，同时应用PCR技术对HPV进行检测，研究证实HPV阴性与HPV阳性的HNSCC患者中常见生物标记物MT2A、MMP9、FLT1、VEGFA和POU5F的表达有一定差异，这对预估HNSCC患者的疾病发展及生存率有重要意义。
与此同时，由于HTS技术高灵敏度的特性，在肿瘤液体活检中也应用广泛。肺癌是我国男性中发病率最高的癌症，其中要的发病类型为非小细胞肺癌(NSCLC)，而在NSCLC靶向治疗中，基因突变检测必不可少。Dono等收集了42例患者血液样本，用HTS技术对血浆ct DNA中EGFR基国20外显子T790M的突变进行检测，以评估已经对第一、二代EGFR-TKI治疗产生耐药性的患者能否继续接受第三代EGFR-TKI药物奥西替尼的治疗，该研究发现由于HTS极高的灵敏度及检出率，使得液体活检更有效地代替了组织检测，提高了患者依从性[10]。
在遗传病中的临床应用
《中国出生缺陷预防报告》的数据显示，我国每年约有100万新生儿患有出生缺陷，而遗传是造成先天缺陷的因素之一。遗传病是因遗传物质发生改变或致病基因控制导致的疾病，一般分为染色体综合征、单基因遗传病及多基因遗传病。近年来，分子诊断技术在遗传病诊断、新生儿筛查等领域发挥着重要作用。
基因芯片作为一种新兴技术，正逐步取代核型分析在产前诊断的地位。aCGH技术能在全基因组水平快速检出染色体CNV，同时检测出变异来源。Chong等应用aCGH技术对1000余例超声检查异常的胎儿进行产前诊断，由于aCGH芯片技术的高分辨率，其与超声检查联合应用将提高检测的准确性[11]。
高通量测序技术可一次性对几十万到几百万的DNA分子进行序列测定，是当前最热门的技术之一。对于染色体非整倍体疾病的检测，可以通过HTS对母体cfDNA进行测序，利用生物信息工具分析外周血中不同染色体的差异，从而对胎儿染色体出现的非整倍体变化进行精准识别。Bianchi等应用HTS进行了大规模平行测序，对美国21个中心的1914名妊娠女性血液样本进行三体21和18的检测，与传统筛查方法相比，HTS技术假阳性率降低显著，准确率高[12]。
在感染疾病中的临床应用
感染性疾病是因人体感染细菌、病毒、真菌等病原微生物而引起的疾病。WHO统计显示，每年有1700万人死于感染性疾病。传统的病原诊断耗时长、精准性低，而分子诊断更加快速、准确，使得疾病能得到及早治疗、控制病毒莫延，是病原体检查的主要发展趋势。
PCR技术既可以检测疾病中的毒力因子、致病因子或变异因子，也可以测定病原体的DNA和RNA，在检测出病因的同时，还可以对病原体进行基因分型和耐药性检测，因此应用广泛。常规PCR检测的病原单一，对于临床上各种混合感染的检测较为困难。而多重PCR(mPCR)技术可以解决这一问题。张海邻等利用mPCR技术对儿童下呼吸道感染的病原体进行快速检测，这对于后期的指导用药有很高的临床价值[13]。
分子诊断已经发展成为一门解决许多科学和医学问题的重要学科，在临床广泛应用中对疾病预防、诊断、预估预后、制定个体化医疗方案等起着促进作用。随着我国人口老龄化的进程，癌症、慢性病等发病率会持续升高，同时国民健康意识也在逐渐提升。分子诊断技术将呈现自动化趋势，以减少人工消耗，降低成本，检测结果自动化判读也会减低人工误差。同时，单分子技术的突破也使得检测高灵敏度成为分子诊断技术未来发展趋势，提升检测效率。另外，无创检测及微创检测等检测手段会提高患者依从性，利于分子诊断技术在临床中的进一步推广和应用。未来几年，分子诊断技术将更加广泛地应用到体检、重大疾病早期诊断、预防及治疗中。
参考文献
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