样本前处理----减少分析误差的手段
原 理
样品前处理是指分析测定前的一系列准备工作，将待测物与样品基质或样品中的干扰物质分离，使其达到仪器可分析状态。
目 的
许多复杂样本以多相非均一态的形式存在，如大气中所含油气溶胶和浮尘，废水中含有的乳液、固体微粒与悬浮物，土壤中的水分、微生物、石块等，所以，复杂的样本必须经过前处理后才能进行分析测定。无论是临床生物样本还是普通健康受试者生物样本,其中都含有大量的内源性大分子,使得分析结果易受基质效应的影响。因此，样本前处理的目的是：
1.浓缩痕量的被测组分，提高方法的灵敏度，降低检测限；
2.去除样本中的基体与其他干扰物质；
3.通过衍生化以其他反应，使被测物转化成为检测灵敏度更高的物质或转化为与样本中干扰组分能够分离的物质，提高方法的灵敏度和选择性；
4.浓缩样本的质量与体积，便于运输与保存，提高样本的稳定性，使之不受空气的影响；
5.保护分析仪器以及测试系统，以免影响仪器的性能以及寿命；
生物样本的一般处理原则
目前，常用的生物样本种类有血样(血浆、血清、全血)、尿液、泪液、粪便等。这类样本易得且便于处理分析，也可反映浓度与药物效应之间的关系。进行生物样本分析时，除极少数情况下将样品进行简单处理就可直接测定外，其他都需采取分离、净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术为测定创造良好的条件。例如，生物样品均匀化体液样品（尿液、血浆等）需采取涡旋混匀；固体样品（如组织、粪便等）则需加入适量溶剂进行高速匀浆处理。
技 术
目前，生物样本的常用处理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等。
蛋白沉淀法（PPT）
① 原 理
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。蛋白沉淀是蛋白组前处理的重要一步，影响因素包括溶剂类型、离子强度、沉淀时间、温度等。不同沉淀条件会带来不同的蛋白回收率以及蛋白组覆盖率。血浆，血清和全血等样本中含有丰富的可溶性蛋白，这些蛋白质组分不仅会干扰分析物的检测，导致严重的基质效应，还可能会堵塞色谱柱和仪器管路，损坏仪器。因此，需要除去样本中的蛋白质。
② 优 缺 点
临床质谱领域常用方法是加入有机溶剂，降低水的介电常数，使具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。此法的分辨能力优于盐析法，即蛋白质只在一个比较窄的有机浓度下沉淀；且沉淀后不用需考虑除盐，过滤较为容易。但缺点是仅去除了蛋白质，内源性杂质还有残留，长时间检测可能会对色谱柱和仪器的寿命产生影响。加入有机溶剂过多，处理后的样本浓度将被稀释，不仅检测灵敏度下降，还可能导致溶剂效应。
图1 监测磷脂分子MRM（来源网络）
液液萃取法（LLE）
① 原 理
液液萃取法是根据分析物的相似相容原理，利用分析物与干扰物在两种不相容的溶剂中分配系数不同，使分析物从干扰物中分离，从而达到样品的净化。采用液液萃取法处理样本时，分析物从样本的水层迁移至有机溶剂层，离心后取出有机溶剂层，氮气吹干后用能与水互溶的溶剂重构样本。因此，液液萃取法适合分析极性小的化合物时对样本的预处理。
图2 液液萃取原理（来源网络）
② 优 缺 点
由于液液萃取法采用的两相迁移的原理，血浆、血清或尿液中的分析物需要从水层迁移至有机溶剂层，蛋白分子，亲水性小分子在该过程中被去除。因此，液液萃取法净化程度高于蛋白沉淀法，有利于分析灵敏度的提高。另一方面，与蛋白沉淀法常用的甲醇、乙腈等不同，液液萃取法中加入的正己烷、乙酸乙酯或甲基叔丁基醚等溶剂极易挥发，有利于样本的浓缩，因此采用液液萃取法时，可以通过浓缩样本来提高分析灵敏度。类固醇激素、脂溶性维生素，维生素D均为通过液液萃取法浓缩后检测。
而液液萃取法的缺点，一是十分受限于化合物的极性、中等极性化合物的萃取效率很差，无法得到满意的回收率；二是液液萃取法需要提取、离心、氮吹、重构等步骤，操作较为繁杂，不利于自动化；三是液液萃取液所用的溶剂挥发性较大，对环境不够友好。
固相萃取法(SPE)
① 原 理
固相萃取（SPE）柱可以理解为特殊的色谱柱，原理与色谱柱分离原理大致相同。样品通过充满了吸附剂的一次性萃取柱后，根据分析物和干扰物与萃取柱吸附剂的结合能力不同，可用不同极性的溶剂分步除去杂质，最后洗脱出分析物，达到分离和富集分析物的目的。按照对干扰物的去除模式的不同，固相萃取可分为过滤板（吸附式）、保留干扰物（通过式）、保留目标物（保留式）三种，其中最常用的为保留式。
图3 固相萃取分类（来源网络）
② 固 相 萃 取 柱 的 选 择
若样本中干扰成分较多、分析物浓度较低，此时为了最大程度地去除干扰物，浓缩样本体积，可采用固相萃取法处理样本。固相萃取法是净化程度最高的样本处理方法，能有效提高分析物灵敏度，同时也是成本最高，通量最低的处理方法。
纯反相填料的固相萃取柱一般适用于中等极性和弱极性化合物的处理。如检测类固醇激素（睾酮、雌二醇、雌三醇、醛固酮）时，一些激素的浓度水平仅为pg级别，此时可用如oasis HLB , Cleanert PEP等反相类型的固相萃取柱处理样本。
离子交换型固相萃取柱则是通过反相和离子交换双重作用实现样本的净化目的。如在分析唾液酸、甲基丙二酸等弱酸性化合物时，选择混合型阴离子交换固相萃取柱(MAX或PAX)处理样本。该类固相萃取柱中的季铵基团能在1~14的PH范围内带正电荷，牢固的结合弱酸性物质的羧基，不带电荷的中性化合物、碱性化合物等干扰组分都可在淋洗步骤中被除去，最后用酸性的洗脱液（甲酸甲醇或甲酸乙腈)抑制住分析物的电荷，分析物被洗脱收集。如在分析克伦特罗、肉碱等弱碱性化合物时，选择混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX或PCX)处理样本。该类固相萃取柱中的磺酸基团能在1~14的PH范围内带负电荷，牢固的结合弱碱性物质的胺基，不带电荷的中性化合物、酸性化合物等干扰组分都可在淋洗步骤中被除去，最后用碱性的洗脱液（氨水甲醇或氨水乙腈)抑制住分析物的电荷，分析物被洗脱收集。
除了以上两款离子交换型固相萃取柱外，还有弱阳离子和弱阴离子交换型固相萃取柱(如 WCX和WAX等)。弱阳离子交换柱中填料中含有羧基，在低PH环境下不带电，高PH环境下带负电荷(如PH>10)。如在分析儿茶酚胺类化合物时，WCX柱中的羧基在碱性环境下与儿茶酚胺的胺基官能团结合，此时用碱性淋洗液可去除样品中的中性、酸性干扰物，最后用氨水甲醇洗脱，通过抑制填料中羧基的电离来解除离子交换作用力，从而分析物被洗脱收集。
图4 不同PH下的化合物状态（来源网络）
传统的固相萃取小柱由于使用负压装置提供淋洗和洗脱的动力，不易控制液滴的流速，不仅操作繁琐，而且样本处理的精密度较差。目前，临床质谱检测项目在使用固相萃取法处理样本时，大多都采用96孔型固相萃取板或将固相萃取填料键合至磁珠表面，采用正压的方式来控制液滴的流速，极大地提高了操作的平行性，有利于样本处理的自动化进程。
近年来发展起来的上述样品前处理方法虽各有特点，但也存有弊端。作为分析结果的重要一环，样本前处理决定了实验的成败，通过本篇希望能让大家了解样本前处理的重要性，也希望本篇对大家有所帮助。
